Cómo calibrar Columnas HPLC

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) tiene numerosas aplicaciones en análisis de laboratorio. Como paso previo a la realización de un análisis real, es importante para calibrar un sistema de HPLC, incluyendo la columna cromatográfica, que produce la separación de analitos químicos. La calibración asegura que diversos analitos pueden ser identificados por su tiempo de residencia dentro de la columna, así como cuantificado de acuerdo con la magnitud de su respuesta del detector.

instrucciones

Calibración de la columna HPLC

1 Decidir sobre los parámetros del método HPLC bajo las cuales va a calibrar la columna. Estos incluirán factores tales como el disolvente utilizado la fase móvil particular, la tasa de flujo de disolvente, el tipo de sistema de detector y los ajustes del detector, así como el producto químico se le probando para (el analito). A menudo un método existente se puede utilizar, por ejemplo, uno especificado por un organismo regulador (la Agencia de Protección Ambiental, por ejemplo).

2 Preparar una serie de soluciones de calibración estándar. Estos se pueden preparar disolviendo cantidades crecientes de la sustancia química analito en un disolvente adecuado. El disolvente se especificará por el método, o, a menudo el mismo disolvente usado para la fase móvil puede trabajar para disolver el analito. Un conjunto de calibración típica consistiría en cinco o seis soluciones, que abarca un intervalo de concentraciones de cero a 100 partes por millón.

3 Encienda el HPLC y sus componentes asociados, tales como la bomba de fase móvil, detector y equipo de adquisición de datos.

4 Conecte la entrada de la columna a la línea de salida de la bomba de disolvente y conecte la salida de la columna a la línea de entrada del detector.

5 Encienda la bomba para comenzar el flujo de la fase móvil a través de la columna a la velocidad especificada por el método. En ausencia de un método estándar, una velocidad de flujo de 1 a 2 mililitros por minuto es típico.

6 Inyectar cada solución de analito estándar en el HPLC, de una en una, de menor a mayor concentración. El método especificará el volumen a inyectar, o un volumen típico de 20 a 50 microlitros se pueden utilizar.

7 Para cada inyección, observar la salida del detector de trazas en el equipo de adquisición de datos. Cuando la salida del detector muestra un pico evidente en respuesta al analito de salir de la columna y que pasa por el detector, dejar de adquisición de datos, guardar el archivo de datos en forma electrónica, e inyectar la muestra siguiente.

8 Después se inyectan todas las muestras y un archivo de datos de respuesta del detector se guarda para cada uno, utilizar el software de adquisición de datos para integrar los picos para cada archivo para determinar el tiempo de retención para el analito y el área del pico para cada inyección.

9 Comparación de los tiempos de retención para todas las inyecciones para asegurar que todos están bastante cerca el uno al otro (a menos de aproximadamente más o menos 5 por ciento). Registre esto como el tiempo de retención para ese analito en la columna para ayudar en el análisis futuro de las muestras desconocidas.

10 Usando el software de adquisición de datos, o un programa como Excel, introducir una serie de puntos de datos que constan de las concentraciones de analitos solución estándar y las áreas de los picos correspondientes. Tiene el software genera una ecuación lineal que relaciona los dos en la forma de: Área del pico = (m) (Concentración) + b, donde m es la pendiente y la ordenada al origen b. Esta es la ecuación de calibración para ese analito en esa columna.

Consejos y advertencias

• Tenga en cuenta que la calibración realizada aquí también depende de la instrumentación de HPLC asociado, tal como el detector y la bomba. Si la columna se trasladó a otro HPLC, o si se cambian las condiciones, tales como caudal de disolvente, la calibración debe repetirse.
• Los tiempos de retención pueden cambiar con el tiempo debido a diversos factores tales como el desgaste de la columna. La HPLC debe ser recalibrado a menudo, incluso si no se realizan cambios en el instrumento o método.