gel de agarosa y acrilamida

Los geles de agarosa vs. Los geles de acrilamida

September 13

Los geles de agarosa vs. Los geles de acrilamida


geles de agarosa y geles de acrilamida se usan en laboratorios de biotecnología para un proceso denominado electroforesis, que se utiliza para separar moléculas de diferentes tamaños. La electroforesis se utiliza para la separación de diferentes tamaños de ADN y las proteínas.

electroforesis en geles

El propósito de un gel de electroforesis es proporcionar un medio por el cual las moléculas se mueven al ser separados. De diferentes tamaños moléculas se moverán a través del gel a diferentes velocidades cuando se aplica una corriente eléctrica.

agarosa

La agarosa es una cadena de azúcar derivados de algas y geles hechos de que son fáciles de preparar. Pueden ser hechos en concentraciones de 1/2 a 2 por ciento de agarosa en una solución tampón.

acrilamida

geles de acrilamida, también llamados geles de poliacrilamida, son más difíciles de fabricar que los geles de agarosa. Pueden ser hechos en 3,5 a 20 por ciento de las concentraciones.

Rango de separación y la Resolución

Los geles de agarosa se pueden separar fragmentos de ADN que van desde 200 a 50.000 pares de bases. La gama de geles de acrilamida es mucho más pequeño, menos de 500 pares de bases. La acrilamida es mejor para la separación de proteínas, ya que la resolución es mejor que la de geles de agarosa. También se puede utilizar para separar el ADN que se diferencia sólo por un solo par de bases.

peligros

La agarosa es no tóxico y seguro de manejar. La acrilamida es tóxico, por lo que se debe tener cuidado en su manipulación.

Cómo interpretar en gel de agarosa

May 15

Cómo interpretar en gel de agarosa


Una vez que se le han acabado las muestras de ADN en un gel de agarosa y se tome una foto, se puede guardar la imagen para más tarde, momento en el cual se pueden analizar los resultados e interpretarlos. El tipo de cosas que usted está buscando dependerán de la naturaleza de su experimento. Si estás haciendo la huella de ADN, por ejemplo, usted quiere comparar el tamaño de los fragmentos de ADN a partir de dos muestras - del sospechoso y de una muestra de la escena del crimen, tal vez. Si está trabajando con plásmidos de bacterias, por el contrario, puede que tenga que asegurarse de que el plásmido contiene el inserto. En consecuencia, la forma de interpretar el gel dependerá en parte en el experimento que hizo. Sin embargo, hay algunas reglas generales que se pueden aplicar.

Instrucciones

1 A partir de la parte superior de la imagen, medir la distancia a cada banda en el carril de "normas" de su gel (también conocido como la escalera). El carril de las normas contiene trozos de ADN cuyo tamaño ya se conoce, por lo que ya debe saber el tamaño de cada uno antes de comenzar el experimento. También medir la distancia recorrida por las bandas en cada uno de los carriles de muestra.

2 Divida la distancia cada estándar y cada banda en las muestras recorridas por la distancia a la parte inferior del gel. El resultado se denomina la movilidad relativa. Puede utilizar el programa de hoja de cálculo para hacer la aritmética para usted si va a realizar este paso más rápido.

3 Introduzca la movilidad relativa y el tamaño de cada estándar en su programa de hoja de cálculo, a continuación, utilizar la herramienta gráfica de su programa de hoja de cálculo para crear una gráfica de estos datos con movilidad relativa en el eje x y el tamaño de la y.

4 Se ajusta una línea de la gráfica mediante regresión no lineal. Consulte la sección de Ayuda de su programa de hoja de cálculo, si lo que necesita saber cómo hacer esto. Usted debe terminar con una ecuación, tal vez uno similar al siguiente:

y = (0,3) x ^ -2,5

Tenga en cuenta que x aquí será la movilidad relativa, mientras que Y es el tamaño. Tenga en cuenta también que la ecuación puede tener completamente diferentes números para el exponente y el coeficiente de - esta ecuación es sólo proporciona como un ejemplo hipotético.

5 Tome la movilidad relativa de las bandas de la muestra y conectarlo cuando x para calcular el tamaño de los trozos de ADN en las bandas de muestra.

Supongamos que la ecuación derivada por su programa de hoja de cálculo fue hecho y = (0,3) x ^ -2.5, y la movilidad relativa de una banda determinada muestra fue de 0,68. La sustitución de 0,68 en la ecuación, se encuentra lo siguiente:

y = (0,3) (0,68) ^ - 2,5

Usar la calculadora, se eleva 0,68 hasta el -2,5 y encontrar el siguiente:

y = (0,3) (2,62)

y = 0,786

que luego será el tamaño estimado en kilobases de ADN en una de las bandas de su muestra.

Los plásmidos

6 Tenga en cuenta que usted puede o no puede necesitar utilizar las instrucciones de esta sección. electroforesis en gel de agarosa se utiliza a menudo para confirmar que un plásmido que contiene un inserto de dado. Si usted no está trabajando con plásmidos, puede omitir esta sección. Si no está, sin embargo, puede seguir estas instrucciones.

7 Observe que si se está trabajando con plásmidos no cortados o mellados, no se puede estimar el tamaño utilizando el procedimiento del apartado 1 anterior. Esto se debe a plásmidos sin cortar y mellados migran a diferentes velocidades de ADN lineal.

8 Comparar el número de bandas en cada carril. Recordemos que un enzima de restricción corta el ADN en sitios donde una secuencia dada llamado el sitio de restricción se produce. Si una muestra se trató con dos enzimas de restricción, una banda para la pieza de inserción y una banda para el resto del plásmido deben tanto estar presente. Esto se debe a la inserción será flanqueado por dos sitios de restricción, cada uno por una enzima diferente, por lo que los cortes en ambos sitios se liberar el inserto del plásmido. Un corte en un solo sitio, por el contrario, convertirá el plásmido de ADN lineal. Una muestra cortada sin enzimas de restricción o enzima de restricción de uno, entonces, debería figurar una sola banda, mientras que una muestra corta con dos enzimas de restricción deberían disponer las dos bandas.

9 Esté atento a las bandas creadas por el ADN plásmido mellado. Un plásmido mellado tiene un corte en un solo filamento, por lo que migra más lentamente que un plásmido cortado. plásmidos cortados a su vez migran más lentamente que el ADN no cortado.

10 Estimar el tamaño de la inserción utilizando el procedimiento descrito en la Sección 1 y determinar si coincide con sus expectativas (que variará dependiendo del experimento).

Cómo solucionar problemas de agarosa electroforesis en gel

August 14

fragmentos de ADN a menudo se separan en base al tamaño mediante un proceso denominado electroforesis en gel de agarosa. Ya que el ADN está cargado negativamente, fragmentos de ADN se moverán en un campo eléctrico. Mediante la carga de una muestra que contiene fragmentos de ADN en los pocillos en una placa de gel de agarosa y la aplicación de un campo eléctrico, un científico o técnico pueden separar los fragmentos de ADN, como fragmentos más pequeños se moverán a través del gel más rápidamente que las grandes. electroforesis en gel de agarosa se utiliza ampliamente en la huella de ADN y la secuenciación del ADN, pero a veces los resultados no son satisfactorios y el procedimiento requiere la solución de problemas.

instrucciones

1 Intente aumentar la cantidad de ADN que se agrega a los pozos si las bandas de ADN son débiles o ausentes. La concentración puede ser insuficiente, o la cantidad podría ser demasiado poco. Asegúrese de que, sin embargo, que la cantidad de ADN por pocillo no debe exceder del 50 nanogramos. También es posible que el ADN fue degradado; comprobar el procedimiento que está utilizando para purificar o amplificar el ADN para asegurarse de que no está contaminando la solución con nucleasas (enzimas que degradan el ADN). Si está tinción con bromuro de etidio para visualizar el ADN, utilizando la fuente de luz equivocada también podría causar este problema. Trate de usar una longitud de onda corta como 254 nanómetros para una mejor lectura.

2 Intente comprobar la tensión que está utilizando si se observa que las bandas de ADN que faltan. Si se utiliza demasiado voltaje o la electroforesis de la muestra durante demasiado tiempo, pequeños fragmentos de ADN pueden migrar todo el camino a través de la losa y la derecha del gel. Trate de repetir el procedimiento, pero con una tensión inferior o durante un período de tiempo más corto. Tensión no debe superar los 20 voltios por centímetro. También es posible que no haya suficiente tiempo para el procedimiento, en el que las moléculas de ADN caso de tamaño similar no pueden estar separados por una distancia suficiente que puede resolver con claridad. Trate de repetir el procedimiento durante un período de tiempo más largo. También es posible que necesite un mayor porcentaje de gel, es decir, un gel que tiene más de agarosa y es por lo tanto más gruesa y menos permeable. Asegúrese de que la memoria intermedia se utiliza cuando se mezcla el gel es el mismo que el tampón de electroforesis.

3 Trate de disminuir la cantidad de ADN se agrega si observa las bandas salen manchadas. También es posible que hay demasiada sal en el ADN o que la muestra está contaminada con proteínas; comprobar el procedimiento que se utiliza para extraer y purificar el ADN de electroforesis para asegurarse de que está siguiendo el protocolo de su laboratorio. También comprobar la capacidad de amortiguación; si el ADN en las cámaras de ánodo y cátodo ha cambiado durante el procedimiento, es posible que tenga la capacidad de amortiguación insuficiente en el tampón de electroforesis. temperaturas demasiado altas o demasiado voltaje también podrían causar este problema; la temperatura no debe exceder los 30 grados Celsius durante este procedimiento. Por último, pequeñas bandas de ADN puede haberse difundido en cierta medida, mientras estaba tinción para visualizar las bandas. Si este último es el problema, trate de añadir el bromuro de etidio durante la electroforesis.

4 electroforesis en gel de agarosa tiene un poder limitado para resolver los fragmentos muy pequeños - aquellos por debajo de 200 pares de bases. Si necesita separar fragmentos de ADN muy pequeñas, es posible que desee utilizar la electroforesis en gel de poliacrilamida en su lugar.

Estructura de la electroforesis en gel

November 24

La electroforesis en gel se utiliza para separar diferentes proteínas de tamaño y el ácido nucleico (ADN o ARN) fragmentos. Es una de las técnicas más comúnmente utilizadas en biología molecular y bioquímica. La electroforesis en gel utiliza una corriente eléctrica para separar mezclas de moléculas a través de un material de gel estacionaria.

Ingredientes gel

El gel está compuesto de cualquiera de agarosa o poliacrilamida, dependiendo de los compuestos a separar. La agarosa es un polisacárido de cadena larga que se aísla a partir de algas. Las concentraciones de agarosa van desde 0,5 por ciento al dos por ciento. Como aumenta la concentración de agarosa, la rigidez de los aumentos de gel. Los geles de agarosa se preparan mezclando el polvo de agarosa con una solución tampón, calentándolo hasta que se funda, y luego verter en la bandeja de fundición gel.

Los geles de poliacrilamida son mucho más difíciles de preparar. Se componen de acrilamida a concentraciones entre 3,5 por ciento y 20 por ciento que se polimeriza. Puesto que el oxígeno interfiere con el proceso de polimerización, los geles se vertieron en entre placas de vidrio.

Usos

Los geles de agarosa suelen trabajar para separar fragmentos de ADN entre 200 y 50.000 pares de bases de longitud.

Los geles de poliacrilamida se utilizan para la separación de mezclas de proteínas. También son útiles en la separación de fragmentos de ADN que son menos de 500 pares de bases de largo.

Técnica

Una vez que se forman los geles, la muestra de proteínas o ácidos nucleicos se deposita en los agujeros, o pozos, en el gel. El gel se sumerge en una solución tampón que ayuda en la estabilización de la transmisión y pH corriente eléctrica. Una corriente eléctrica se aplica entonces al gel. La electroforesis en gel es una técnica de separación efectiva, debido a que las moléculas cargadas se mueven en la dirección de la polaridad opuesta cuando se aplica una carga. A medida que las moléculas se mueven a través de la estructura porosa del gel, las moléculas más pequeñas se mueven más rápido y más lejos a través de los agujeros que las moléculas más grandes. Una vez que la migración de las moléculas es completa, los fragmentos se tiñeron con bromuro de etidio, un colorante fluorescente.

resultados

Después de completar la electroforesis en gel, los científicos de laboratorio examinan los resultados de inmediato para evitar una mayor migración de las partículas dentro del gel. La losa de gel se examina en un transiluminador ultravioleta.

consideraciones

Los materiales utilizados durante la electroforesis en gel de un impacto significativo en la eficacia de la separación de moléculas. La concentración del gel utilizado influye en la facilidad con la que las moléculas son capaces de viajar. La tensión aplicada afecta a la velocidad de las moléculas, lo que permite moléculas más grandes para mover proporcionalmente más rápido que las moléculas más pequeñas con una mayor tensión. La solución tampón también influye en la velocidad de migración de las moléculas.

Electroforesis en gel Protocolos

December 9

Electroforesis en gel Protocolos


La electroforesis en gel utiliza la capacidad de las moléculas a pasar a través de un gel o matriz en respuesta a una corriente eléctrica. Se separa las proteínas, ADN o ARN basado en el tamaño y la carga de la molécula. La electroforesis en gel se utiliza en la medicina forense, la genética, el análisis de proteínas y la biología molecular. Las moléculas en el gel pueden ser visualizados y registradas por el uso de cámaras y ordenadores.

Western Blotting

Western Blot permite el estudio de proteínas específicas mediante el uso de electroforesis en gel y anticuerpos. Las proteínas a menudo tienen una estructura compleja y necesitan ser desnaturalizado con el uso de calor y detergentes; Estas sustancias también capa de la proteína para dar una carga negativa. Las proteínas se mueven a través del gel, por lo general de acrilamida, en base a su tamaño. Una vez separado del gel las proteínas se pueden transferir a una membrana, que entonces se pueden teñir para proteínas específicas utilizando anticuerpos. Las proteínas se pueden visualizar utilizando numerosas técnicas y la cantidad de proteína se puede determinar.

zymography

Zymography se basa en enzimas de transferencia pero los estudios occidentales. La acrilamida en el gel se copolimeriza con un sustrato tal como gelatina. A diferencia de la transferencia Western, las enzimas no son tratadas con un detergente. Una vez que las enzimas se han movido a través del gel, la acrilamida es químicamente eliminado, y el gel se coloca a 37 grados Celsius en un tampón para promover la actividad de la enzima. El gel se tiñó con frecuencia con azul de Coomassie y las áreas de actividad de la enzima se mantendrá sin teñir o claro.

En gel de agarosa La electroforesis

electroforesis en gel de agarosa puede separar las proteínas, ARN o ADN. Los ácidos nucleicos se separan por su tamaño, con las moléculas más pequeñas en movimiento más rápido a través del gel, mientras que las proteínas se separan por la carga debido al tamaño de los poros en un gel de agarosa. Estos geles se pueden utilizar en la genética para estudiar los ácidos nucleicos. Para visualizar ácido nucleico, que es fluorescente bajo luz ultravioleta (UV), bromuro de etidio se utiliza a menudo; Sin embargo, bromuro de etidio causa mutaciones genéticas, de manera alternativas más seguras.

Electroforesis bidimensional

electroforesis de dos dimensiones se utiliza para las proteínas separadas. Las proteínas se separaron por su carga y luego por su masa. Se utiliza a menudo en la proteómica para estudiar la expresión global de proteína en un tejido u organismo y también puede determinar las diferencias en la expresión de proteínas entre los tejidos.

Cómo hacer Almidón de gel para electroforesis

July 19

Para el análisis de ADN a través de electroforesis, primero debe preparar el gel. Como su nombre implica, el gel se hace de una mezcla de un almidón llamado de agarosa, que generalmente se vende en forma de polvo. Nunca mezclar el gel con agua pura - siempre hay que usar tampón o de lo contrario tendrá problemas cuando intenta ejecutar el gel. El siguiente procedimiento es para cámaras de electroforesis del tamaño se encuentran típicamente en los laboratorios de enseñanza; si su unidad es más grande o más pequeño, ajustar las cantidades de cada producto químico, según proceda.

instrucciones

1 Mezclar 350 ml de solución tampón 1X TAE. Dado que la población original es 10 veces más, usted debe dosificar 35 ml de la 10X a continuación, añadir 315 ml de H2O desionizada (H2O destilada) y agitar suavemente para mezclar. Lo único que necesita 50 ml para hacer realidad el gel de agarosa; el tampón restante se utiliza en la propia cámara de electroforesis.

2 Verter 50 ml de la solución tampón 1X en el erlenmeyer. Mide 0,5 g de agarosa y añadirlo al matraz, a continuación, girar para mezclar.

3 Poner un Kimwipe en la boca del frasco y colocarlo en el horno de microondas. Calentar durante 1 minuto. NO deje desatendida - apagar el microondas una vez que la solución en el matraz empieza a hervir. Si se sobrecaliente la solución, se salpicará el microondas y hacer un lío mucho tiempo.

4 Con una pipeta Pasteur, había una línea fina de gel a lo largo del lugar donde los deflectores en la cámara de electroforesis tocan el lecho de gel. Coloque el peine sobre el lecho de gel de manera que los dientes de la cara hacia abajo hacia la cama. Ajuste de la profundidad de los dientes con los tornillos de peine hasta que estén justo por encima de la parte inferior de la placa. No deben estar tocando la placa.

5 Deje que el gel fresco a aproximadamente 60 grados centígrados - y en ese momento el matraz aún estará caliente al tacto. Añadir colorante (por ejemplo, bromuro de etidio o SYBR-safe) según las indicaciones de su protocolo.

6 Se vierte la agarosa en el lecho de gel y deje que se enfríe hasta que se solidifica.

¿Cómo se visualizaron utilizando ADN electroforesis en gel?

December 28

Bromuro de etidio

Por esta técnica de visualización, bromuro de etidio se mezcla con el polvo de agarosa, tampón de EDTA y agua para formar la matriz de gel antes de la electroforesis. Como resultado, las moléculas de bromuro de etidio convertido dispersan uniformemente por toda la matriz. Una vez que los pozos del gel se han llenado con sus respectivas muestras de ADN y tintes de seguimiento, se aplica tensión para dibujar lentamente los compuestos polares grandes, a través de la matriz.

Durante este movimiento, las bases de las moléculas de ADN se unen temporalmente a las partículas de bromuro de etidio, arrastrándolos a lo largo. Por el tiempo de electroforesis es completa, cada molécula de ADN se ha recogido en cantidad significativa de bromuro de etidio.

En presencia de luz ultravioleta, exposiciones de etidio bromuro de fluorescencia. Los técnicos brillar una luz UV calibrada especialmente a través del gel, mientras que una máquina capta la imagen de los fragmentos brillantes.

Azul de metileno

Si un transiluminador UV no está disponible o práctico, los técnicos pueden hacer DNA visible en condiciones normales empapando el gel de agarosa acabado, con el ADN electrophoresized dentro, en una solución de azul de metileno durante la noche.

Una sal con un anión cloruro significativamente hidrófoba, las moléculas de azul de metileno penetrar la matriz de gel entera. Sin embargo, la unión de hidrógeno a lo largo de DNA hace que las moléculas de la mancha a acumularse. Este aumento de la densidad de la mancha alrededor del ADN produce un tono más oscuro de azul, visible al ojo desnudo.

Los tintes de seguimiento

Más allá de la dimensión relativa de las bandas de ADN, los técnicos pueden medir el tamaño absoluto (en pares de bases) de cada fragmento usando productos químicos llamados colorantes de rastreo. Visibles sin la adición de bromuro de etidio o azul de metileno, el seguimiento de colorantes tales como azul de bromofenol y xileno cianol movimiento a través de las matrices de gel durante la electroforesis aragose a la misma velocidad como fragmentos de ADN que consta de 300 nucleótidos y 4.000 nucleótidos, respectivamente. En la electroforesis, los fragmentos más grandes de ADN viajan a través de la matriz de gel a una velocidad más lenta que fragmentos más pequeños.
Por lo tanto, mientras que el seguimiento colorantes no influyen directamente en la visibilidad de los fragmentos de ADN, comparando la posición de un fragmento de ADN en el gel a la posición de estos colorantes permitir que los técnicos "ver" el número aproximado de nucleótidos del fragmento de ADN contiene.

Las ventajas y desventajas de la electroforesis del gel para las huellas digitales de ADN

January 17

Las ventajas y desventajas de la electroforesis del gel para las huellas digitales de ADN


la huella de ADN es un método tecnológico para identificar organismos específicos o personas individuales. Una herramienta común utilizada para este método es la electroforesis en gel. Como con cualquier herramienta, siempre hay ventajas y desventajas en su uso. Independientemente de pros y los contras del método, electroforesis en gel todavía ha jugado un papel valiosas investigaciones en los laboratorios científicos.

Costo

La ejecución de una electroforesis en gel es una herramienta rentable para la toma de huellas dactilares de ADN. Hay una variedad de tamaños para elegir en función de la cantidad de muestras de sujetos y la frecuencia relativa de la máquina se está ejecutando. Algunas máquinas tienen aproximadamente el tamaño de un libro de bolsillo y otros son del tamaño de una mesa. El medio utilizado para el gel es otro elemento rentable. Un tipo gel común es el gel de agarosa, que está compuesto principalmente de una solución tampón. Se necesita esta solución para conducir la electricidad de un lado a otro, y por lo general es reciclado para otro electroforesis.

Facilidad de uso

Los estudiantes universitarios harán y ejecutar su propio electroforesis en gel en un curso de biología típico. Ya que es uno de los aparatos utilizados comúnmente utilizadas en un laboratorio de biología, es también uno de los más sencillos de utilizar. Un gel se realiza utilizando una fórmula específica, que puede ser calculado de antemano. Después de cargar las muestras, el aparato se cubre con una cubierta de seguridad, los electrodos se ponen en su lugar y la corriente eléctrica pasa a través de la máquina. La única parte complicada de la operación es saber cuándo parar la máquina. Algunos aparatos tienen temporizadores para apagar la máquina antes de que las muestras salido del gel.

recuperación de la Muestra

Un gel de agarosa tiene las ventajas de ser capaz de recuperar la muestra de ADN después de que se ejecute la prueba. El gel mismo no se desnaturaliza el ADN hasta el punto de que es inutilizable. En la huella de ADN, una electroforesis en gel se puede hacer para separar los fragmentos. Los fragmentos pueden entonces ser cortados y aislados para ejecutar otra prueba. Sin embargo, en algunos casos los fragmentos de ADN pueden fundir debido a la corriente. En este caso, la muestra es capaz de ser recuperado y la colocación del fragmento de ADN en el gel puede ser alterado a partir de donde realmente debe ser.

fragmentos

Una desventaja en el uso de una electroforesis en gel para la huella dactilar de ADN es que los fragmentos tienen que hacerse de una manera específica. Las enzimas de restricción son proteínas que se corte una cadena de ADN en un sitio de reconocimiento muy específico, una secuencia de codificación específica. Hay un montón de enzimas de restricción en el mercado, pero que sólo se cortan donde hay un sitio de reconocimiento. Esto significa que podría o no podría ser un sitio específico de una persona a otra. A este respecto, la herramienta de huella de ADN a partir de la electroforesis en gel es sólo tan buena como la enzima de restricción utilizada. Si se emplean más enzimas, más fragmentos se producen, que dan más información para el análisis.

La electroforesis en gel de Cut & Paste Actividades

September 2

ADN recombinante contiene el ADN a partir de dos o más fuentes combinadas para formar una única molécula, y tiene muchas aplicaciones en una amplia gama de actividades. Científicos crean ADN recombinante utilizando técnicas de "cortar y pegar" con enzimas como la ADN ligasa. A menudo, la electroforesis en gel es una de las herramientas utilizadas para analizar el ADN en estos tipos de experimentos.

Cortar pegar

Las endonucleasas de restricción son una clase de enzimas que hacen que los recortes dentro de una molécula de ADN. Se unen a secuencias específicas de bases en el ADN llamados "sitios de restricción". Tipo II enzimas de restricción hacen un corte en el sitio de reconocimiento, y son el grupo que más se utiliza enzimas de restricción. Cuando estas enzimas de restricción hacen un corte, dejan un pequeño voladizo llamado un "extremo cohesivo" en una de las cadenas de la molécula de ADN escindido. Al cortar otro trozo de ADN que quieren insertar con el mismo par de enzimas de restricción, los científicos pueden asegurarse de que tendrá que emparejan extremos pegajosos. Cuando los fragmentos de ADN se mezclan, los extremos pegajosos sobre el inserto se emparejan con los extremos pegajosos de la molécula original escindido; una enzima llamada ADN ligasa a continuación, "colas" de la pegajosa juntos los extremos. En esencia, este proceso toma un fragmento de ADN y lo inserta en otra molécula de ADN en un punto marcado por los sitios de restricción para las enzimas de restricción que utiliza.

Los plásmidos

Muchas bacterias tienen pequeñas piezas circulares de ADN separado de su cromosoma; estas pequeñas moléculas de ADN circular son llamados plásmidos. Los plásmidos son los grandes vehículos para introducir genes en las bacterias, ya sea para producir una proteína o para hacer copias de fragmentos de ADN a través de una técnica llamada clonación. En primer lugar, el fragmento de ADN o gen de interés se inserta en el plásmido usando la técnica de cortar y pegar descrito anteriormente. A continuación, el plásmido se introduce en la bacteria a través de una de las dos técnicas simples: quimoporación o electroporación. Por último, las bacterias se cultivan en lo que se llama un medio selectivo en el que sólo las bacterias que han tomado el plásmido pueden sobrevivir. Cultivo de las bacterias hace que una gran cantidad de copias del plásmido original, y por lo tanto de nuestra pieza de ADN.

El análisis con electroforesis en gel

En la electroforesis en gel, las muestras de ADN se añaden a los pocillos en una placa de gel de agarosa. ADN está cargado negativamente, de modo que cuando se aplica corriente, el ADN se desplaza a través del gel hacia el electrodo positivo. Las piezas más grandes de ADN viajan más lentamente, por lo que a medida que migran las moléculas de ADN se separan sobre la base de su tamaño. Una vez que el ADN recombinante ha sido digerido con las enzimas de restricción (enzimas -paste básicamente cortar y), las muestras de ADN se pueden añadir al gel; los fragmentos más pequeños migrarán por delante de los otros.

Restricción-análisis de fragmentos de longitud polimórfica

La digestión de una muestra de ADN con una enzima de restricción va a producir una serie de fragmentos más cortos. La longitud de estos fragmentos puede variar entre diferentes individuos, por lo que la electroforesis en gel de ADN digerido por restricción de diferentes individuos pueden producir un patrón diferente. Este tipo de análisis se utiliza a menudo en el pasado para mapear las enfermedades hereditarias en las familias; Hoy en día, sin embargo, ha sido suplantada por métodos más eficientes.

Cómo analizar Electroforesis en gel

September 24

Cómo analizar Electroforesis en gel


La electroforesis es el movimiento de las moléculas en base a la carga eléctrica. Al tomar ventaja de la porosidad de los geles de agarosa y el hecho de que el ADN tiene un esqueleto de fosfato cargado negativamente, los científicos pueden separar fragmentos de ADN por tamaño en un gel de agarosa mediante la aplicación de una corriente a la misma. Diferentes tamaños de fragmentos dirigidos a diferentes velocidades; pequeños fragmentos se mueven más rápido a través del gel de fragmentos grandes. La determinación del tamaño de una molécula por la separación de la misma de otros fragmentos moleculares ayuda a los científicos en experimentos genéticos y proteómicos.

Instrucciones

1 Póngase los guantes de nitrilo.

2 Transferir cuidadosamente el gel de agarosa de la caja del gel de la caja de la fuente de luz UV. Los geles de agarosa pueden rasgar o romper, por lo que cuando se transfiere el gel, la transferencia de un objeto sólido, plano como una hoja de plástico duro.

3 Póngase las gafas a prueba de UV.

4 Encienda la fuente de luz UV.

5 Tome una fotografía del gel con la cámara.

6 Imprimir la fotografía.

7 Anote los tamaños conocidos de las bandas de fragmentos en el carril de la escalera sobre la base de la llave de la escalera que utilizó directamente en la foto.

8 Determinar el tamaño relativo de las bandas en los carriles de la muestra.

9 Comparación de la talla esperada con el tamaño de la banda medido. Si coincide, su reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la reacción enzimática trabajaron. Si no es así, compruebe los cebadores o plásmidos por segunda vez y confirmar el tamaño esperado. Si la banda sigue siendo un misterio y se repite, considerar el envío de ese pedazo de gel a una instalación de secuenciación de ADN para su análisis.

Consejos y advertencias

  • Hay a menudo una banda compuesta de cebadores en la parte inferior del carril en un gel de electroforesis con bromuro de etidio. Esto no es una banda de ADN replicado y debe ser ignorada.
  • Ejecución de geles más lenta tiende a dar bandas más limpias. Para ello, reducir la corriente en la caja de gel. Si los resultados del gel deben ser publicados, ejecute el gel a una muy baja durante la noche actual.
  • Al manipular geles que contienen bromuro de etidio, siempre use guantes de nitrilo. El bromuro de etidio es una molécula muy pequeña y puede pasar a través de látex.
  • Nunca use cloro para limpiar un área que ha sido contaminada con bromuro de etidio. Lejía reacciona con bromuro de etidio y produce productos de reacción extremadamente peligrosos.
  • Lea la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) para el bromuro de etidio antes de trabajar con él.