Las técnicas para la purificación de proteínas

January 12

Las proteínas son moléculas grandes formadas por cadenas de aminoácidos que se pliegan en estructuras tridimensionales. Las proteínas o complejos de proteínas llevan a cabo muchas de las tareas más importantes en la célula, que van desde catalizar reacciones a funciones estructurales. Los biólogos a menudo necesitan para aislar una proteína específica para estudios posteriores o para otras aplicaciones; que utilizan una variedad de técnicas para hacerlo.

SDS-PAGE electroforesis en gel

En esta técnica, las proteínas se tratan primero con un detergente llamado dodecil sulfato de sodio o SDS, desnaturalización ellos y haciendo que pierdan su estructura. Las moléculas de detergente cargados negativamente forman complejos con las proteínas. A menudo, una sustancia química llamada mercaptoetanol se añade a romper cualquier enlace disulfuro entre residuos de cisteína en la proteína también. A continuación, se añade la mezcla de proteína a los pocillos en una placa de gel de poliacrilamida y un campo eléctrico hace que se migrar en la dirección del ánodo cargado positivamente. proteínas más pequeñas migrarán más rápidamente mientras que las proteínas más grandes migrarán más lentamente, por lo que las proteínas se pueden separar sobre la base de su tamaño o masa molecular.

La sedimentación de velocidad y equilibrio

Una centrífuga es esencialmente un rotor de dos brazos con un tubo en cada extremo. Un motor hace girar el rotor a velocidades muy altas, someter los contenidos de cada tubo a una fuerza muchas veces más fuerte que la fuerza de la gravedad. Las proteínas en la solución migrarán gradualmente hacia la parte inferior del tubo; algunos de ellos, sin embargo, lo harán con mayor rapidez que otros. obras equilibrio de sedimentación basan en un principio similar, pero añade un giro: la muestra se dispersa dentro de un gradiente de densidad formado por una alta concentración de sacarosa o cloruro de cesio. A medida que la centrifugadora gira, proteínas en la muestra migran gradualmente al lugar donde su densidad de flotación es la misma que la de sus alrededores.

Cromatografía de columna

La cromatografía en columna es una técnica poderosa que implica forzar una mezcla a través de una columna rellena con una matriz porosa de perlas o partículas pequeñas. flujo de disolvente desde la parte superior de la columna empuja la mezcla a través de la matriz, pero algunas proteínas o compuestos en la mezcla de interactuar más con la matriz que lo hacen otros y por lo tanto tardan más en emerger. A través de este proceso, la cromatografía de columna se puede separar una mezcla en sus componentes. Hay un número de diferentes variantes de esta misma idea básica. cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo, usa una matriz compuesta de perlas que son o bien cargados positivamente o negativamente, de modo que las proteínas de la carga opuesta se retienen en la columna. La cromatografía de afinidad utiliza perlas o partículas recubiertas con una molécula que se unirá a una proteína específica en la mezcla de - un anticuerpo, por ejemplo, o el sustrato de una enzima (la molécula de la enzima actúa sobre). La proteína de interés se mantendrá en la columna mientras que todos los demás fluyen a través y se pueden eliminar más tarde cambiando el pH o la adición de una solución de sal concentrada.

enfoque isoeléctrico

El enfoque isoeléctrico también implica electroforesis en gel, pero las proteínas no se tratan previamente para desnaturalizar ellos. En su lugar, se añaden a una placa de gel de poliacrilamida, donde tampones especiales se han utilizado para crear un gradiente de pH. Dependiendo de su estructura, diferentes proteínas tienen diferentes puntos isoeléctricos o valores de pH a los que no tienen carga neta. Una vez que se aplica un campo eléctrico, cada proteína migrará hasta que alcanza su punto isoeléctrico.


Artículos relacionados