Los factores que pueden afectar la transferencia de las proteínas en el Western Blot

March 25

Los factores que pueden afectar la transferencia de las proteínas en el Western Blot


transferencia de Western es una manera relativamente sencilla para visualizar las proteínas específicas de lisado celular - la mezcla de las moléculas a partir de células lisadas "" ráfaga o. A menudo, sin embargo, los principiantes tienen mala suerte con conseguir que esto funcione correctamente. Una posible fuente de error implica la transferencia de las proteínas a la membrana de nitrocelulosa o PVDF durante la transferencia electroforética.

Lo esencial

Después de la electroforesis, el gel de poliacrilamida se retira del tanque tampón y las proteínas que contiene son transferidos a una membrana de nitrocelulosa o PVDF. El método más común para la transferencia de proteínas es el método semi-seco. En este enfoque, un papel de filtro y la membrana se colocan sobre el ánodo - un electrodo cargado positivamente. Otra pieza de papel de filtro se coloca encima del gel, seguido por el cátodo. Las proteínas ya han sido desnaturalizado y se recubren con un compuesto llamado dodecil sulfato de sodio, por lo que todos ellos tienen carga negativa. En consecuencia, la caída de tensión entre los dos electrodos atrae a las proteínas del gel y en la membrana. Varios factores afectan la eficacia de esta transferencia.

Corriente

Aunque la tensión y la corriente están, por supuesto, relacionados por la ley de Ohm (V = IR), la corriente es más importante que una tensión en este caso. Si la corriente es demasiado alta, podría causar un sobrecalentamiento. Por otra parte, una corriente de alta también podría causar proteínas más pequeñas para moverse tan rápidamente que no tienen la oportunidad de unirse a la membrana. Elija un tampón que tiene una densidad de carga menor que la corriente llegue a ser demasiado alta; Tris-glicina es un buen ejemplo. Asimismo, asegúrese de frotar encima de cualquier exceso de tampón extiende alrededor de la pila de papel de filtro / gel. Piscinas o salpicaduras de tampón podrían conectar los electrodos directamente, creando un cortocircuito.

Membrana

Usted puede comprar membranas con diferentes tamaños de poro; del tamaño que elija depende del tamaño de las proteínas que desea estudiar. 0,45 micrómetros es una opción común, aunque si el peso molecular de su proteína está por debajo de 20 kilodaltons, es posible que necesite una membrana con un tamaño de poro aún más pequeño. Además, puede seleccionar cuidadosamente la hora de decidir qué tipo de membrana que desea. PVDF es más cara que la nitrocelulosa, pero es menos frágil y se puede sondear repetidamente, mientras que las membranas de nitrocelulosa sólo pueden ser típicamente probaron una vez.

Buffer Químicos

Incluyendo metanol en el tampón es importante, ya que ayuda a eliminar el SDS de sus proteínas para que puedan unirse a la membrana. Añadir demasiado metanol, sin embargo, se elimina la SDS demasiado pronto, antes de que las proteínas han dejado el gel, lo que podría hacer que se agrupen y quedar atrapado en el gel. Dependiendo del tipo de experimento y el protocolo, el 20 por ciento de metanol es una concentración razonable, aunque es importante incluir una baja concentración de SDS así. Este SDS adicional ayuda a las proteínas para eluir, o se extrae, a partir del gel.

La proteína de carga y otros factores

A medida que el metanol se disuelve el SDS, las proteínas se cargan de forma menos negativa. En algunas situaciones esto puede plantear un problema potencial, debido a que las proteínas migran más lentamente a medida que su carga neta se hace menos negativo. Si usted encuentra sus proteínas no transferirá correctamente por esta razón, puede intentar un tampón con un pH más alto, al igual que CAPSO (ácido sulfónico de 3-N-ciclohexilamino-2-hidroxipropano), ya que sus proteínas tendrán una carga más negativa en el pH más alto. Otro factor a considerar es el momento de la transferencia; proteínas más grandes se mueven más lentamente, por lo que necesita para que haya tiempo suficiente para sus proteínas para transferir a la membrana.


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