Cómo preparar una gota colgante

September 21

Para determinar la estructura 3D de una proteína, es necesario en primer lugar un cristal puro de la misma. El método de gota colgante utiliza una gota de proteína que contiene de suspensión de solución a partir de un cubreobjetos. Por debajo de esta gota colgante se encuentra un depósito con una concentración de sal mayor que la de la gota. Con el tiempo, el vapor de agua sale de la gota y termina en el depósito, haciendo que la proteína a cristalizar. Cada proteína requiere diferentes condiciones (tales como la concentración de sal y pH), y con frecuencia de ensayo y error ofrece la única manera de encontrar las condiciones adecuadas.

Instrucciones

1 Póngase ropa de laboratorio (abrigo, guantes y protección para los ojos).

2 Utilice una micropipeta para añadir 1,1 ml de cloruro de sodio (sal) y una solución de tampón de acetato en un tubo Eppendorf.

3 Centrifugar el tubo de Eppendorf cerrado con la solución de sal en su interior durante unos cinco minutos a 13.000 rpm. Recuerde equilibrar la centrífuga mediante la colocación de otro tubo Eppendorf que contiene 1,1 ml de agua a través de y opuesta al tubo de solución salina.

4 Añadir 1 ml de la solución de sal a un pocillo en una placa de 24 pocillos.

5 Use una jeringa lleno de grasa para colocar una fina capa de grasa alrededor del borde de este pozo. Tenga cuidado de no añadir demasiado poco o demasiado. Si se añade demasiada grasa, la grasa se ejecutará en el pozo y posiblemente arruinar su experimento. Si usa muy poco, el pozo no será hermético y el experimento no funcionará. Trate de que solo la grasa suficiente que el cubreobjetos y la grasa forman un sello hermético más adelante.

6 Enrollar la arcilla con sus manos para hacer cuatro bolas pequeñas, y los empuja hacia las cuatro esquinas de la placa de 24 pocillos. Ellos actuarán como soportes para asegurar la cubierta de la placa no entra en contacto con el cubreobjetos.

7 Utilice aire comprimido para soplar el polvo fuera del cubreobjetos. Mantenga el cubreobjetos con un par de pinzas limpias.

8 Aspirar 4 microlitros de la solución de lisozima con su micropipeta, y añadir esta solución a la centro del cubreobjetos. Cambiar las puntas de pipeta, y añadir 4 microlitros de la solución de sal. pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo, la succión en el líquido a continuación expulsándola, para mezclar la solución salina con la solución de lisozima. Tener cuidado para mezclar los dos sin dispersar el fluido en todo el cubreobjetos.

9 Gire el cubreobjetos sobre rápidamente para que el líquido no se desliza hacia fuera, y la planta de lleno en lo alto del pozo. Tener cuidado para presionar suavemente sobre el mismo por lo que forma un sello hermético con la grasa alrededor de los bordes del pozo.

10 Empuje la cubierta de la placa de 24 pocillos sobre las bolas de arcilla, y dejar la placa en un lugar fresco.


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