Cómo leer la electroforesis de proteínas

May 18

Cómo leer la electroforesis de proteínas


De sodio dodecil sulfato de electroforesis en gel de poliacrilamida-(SDS-PAGE) es un método bioquímico de la identificación de proteínas en solución. Como se ilustra por Mathews et al en "Bioquímica," muestras de proteínas se cargan primero en "pozos" o agujeros en un extremo del bloque de gel de poliacrilamida. Un campo eléctrico se aplica luego al gel. SDS, añadido a las muestras cargadas, niega la carga natural de las proteínas. Por esta razón, el peso molecular proteína sola determina la velocidad de migración de las proteínas a medida que avanzan a través del gel hacia el polo cargado positivamente, toma nota de Bitesize Bio. Múltiples proteínas en la misma muestra se, por lo tanto, separar el uno del otro y migrar a diferentes posiciones.

instrucciones

1 Orientar la fotografía de un gel. "Top" es la ubicación de los pocillos en los que se añadieron inicialmente las muestras. "Inferior" es donde las muestras migraron hacia y más a menudo contiene el frente de colorante que indica el frente de migración de las muestras. O bien la izquierda o hacia la derecha debe contener un "marcador", utilizado como guía peso molecular predecible.

2 Etiquetar las muestras para cada carril. En la parte superior, las muestras a los pocillos se han migrado verticalmente en "carriles". Por lo tanto, todas las barras visibles en una columna vertical vinieron de la muestra cargada directamente por encima de ella. Utilice la regla y la pluma para poner fronteras en los carriles si es difícil de visualizar columnas.

3 Etiquetar los tamaños moleculares de las bandas en el carril marcador. Comercialmente disponibles marcadores vienen con una imagen del patrón de bandas a esperar junto con los pesos moleculares de cada banda. Las bandas son las "barras", horizonal oscuros que en realidad se tiñen de proteínas incorporado en el gel.

4 Dibujar líneas horizontales de luz que se extienden hacia fuera de cada banda de marcador para el borde opuesto del gel. Tenga cuidado para que estas líneas paralelas a los pocillos y a la parte delantera del colorante. Estas líneas indican que las proteínas del peso molecular indicado por cada una de las bandas marcadoras estarían situados en cada carril. Por ejemplo, una banda en el carril 4 que se encuentra justo debajo de la línea extendida de la banda de marcador 25-kilodalton sugeriría que la banda de carril 4 es casi pero no del todo 25 kilodaltons de peso molecular.

5 Etiqueta de cada banda en cada carril con su peso molecular estimado. Utilice los marcadores a modo de guía, y estimar valores entre tamaños de los marcadores.

6 Por debajo de la fotografía de un gel, hacer una lista de "proteínas" para cada carril. Empezar diciendo lo que se conoce acerca de cada muestra, como su origen o condiciones. A continuación, la lista el peso molecular estimado de cada banda en el carril. Carriles con una banda indican que la muestra contiene sólo una proteína. Lanes con múltiples bandas indican la presencia de múltiples proteínas. Bandas que se ejecutan con el frente de migración son más pequeñas que las sugeridas por el marcador más cercano y es probable que no se pueden predecir, excepto como "menor que" el marcador indica.

7 En la lista de proteínas, tenga en cuenta las singularidades. Un aspecto "manchado" puede indicar que muchas proteínas están presentes o que la viscosidad de la muestra afectada su migración Si las bandas parecen ir más allá del borde de la pista o son bastante grandes en comparación con otras bandas, a continuación, la concentración de que la proteína es probablemente demasiado alta y debe ser diluido en el futuro electroforesis. Un matiz grisáceo a lo largo del carril, más oscuro que el color de fondo de gel, indica fragmentos de proteínas indistinguibles.

8 Determinar la identidad de las proteínas en cada carril. Aunque esto se realiza usando sólo el peso molecular, la fuente de cada carril es probable indicar pistas también. Considere que bajo algunas condiciones, las proteínas pueden mantener una asociación dímero o trímero en un gel. Por lo tanto, una proteína puede aparecer en un gel como tres bandas distintas. Incluso si las proteínas no pueden ser identificados, la oscuridad relativa de las bandas puede implicar las concentraciones de las proteínas en solución. Cualquier proteína curiosos y desconocidos se pueden aislar directamente a partir del gel original y enviados para su identificación.


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