Cómo calcular la concentración de anticuerpos

October 19

Cómo calcular la concentración de anticuerpos


Uno de los métodos más comunes de cálculo de una concentración de proteína en un entorno de laboratorio es el uso de un ensayo de Bradford. El reactivo de Bradford es un reactivo colorimétrico que cambia de color en función de la concentración de proteína. Mediante la combinación de una curva estándar conocido con el reactivo de Bradford, puede crear una medida contra la cual se puede calcular la concentración de cualquier proteína, incluyendo anticuerpos.

Instrucciones

Crear un estándar

1 Mide 200 mg de BSA en un peso de papel utilizando una escala de laboratorio. Encerrarlo en un tubo de microcentrífuga. Añadir 2 ml de tampón al tubo de microcentrífuga que contiene los 200 mg de BSA. Etiquetar este tubo "1"

2 Vortex Tubo 1 hasta que la BSA se disuelve completamente.

3 Eliminar 500 ul de la BSA en tampón y la transfiere a un segundo tubo. Etiquetar este tubo "2." Añadir 500 ul de tampón normal al tubo 2.

4 Eliminar 200 ul de BSA en tampón de tubo 1 y la transfiere a un nuevo tubo. Etiquetar este tubo "3." Añadir 800 ul de tampón normal de tubo 3.

5 Eliminar 100 ul de BSA en tampón de tubo 1 y la transfiere a un nuevo tubo. Etiquetar este tubo "4." Añadir 900 ul de tampón claro para el Tubo 4.

6 Eliminar 10 ul de BSA en tampón de tubo 1 y la transfiere a un nuevo tubo. Etiquetar este tubo "5." Añadir 990 ul de tampón normal de tubo 5. Tubos 1- 5 comprenden una serie de normas para diferentes edades. El primer tubo tiene una concentración conocida de 100 mg / ml; la segunda, 50 mg / ml; el tercero, 20 mg / ml, la cuarta, 10 mg / ml; y la quinta, 1 mg / ml. Cada tubo contiene aproximadamente 1 ml de solución.

Crear anticuerpos diluciones

7 Añadir 5 0UL de anticuerpo purificado a 95 0UL de tampón. Etiquetar este tubo "A"

8 Añadir 10 ul de anticuerpo purificado a 990 ul de tampón. Etiquetar este tubo "B"

9 Añadir 2 ul de anticuerpo purificado a 998 ul de tampón. Etiquetar este tubo "C"

Cargar la placa

10 Colocar 0,5 ml de tampón normal en los primeros pozos en dos columnas de la placa de múltiples pocillos.

11 Colocar 0,5 ml de los contenidos del tubo 1 en la segunda pocillos de las dos primeras columnas de la placa de múltiples pocillos. Continuar por la serie graduada hasta que las dos primeras columnas contienen 0,5 ml de una solución patrón de BSA de cada uno de los tubos 1-5, incluyendo los pozos de tampón de llanura.

12 Añadir 0,5 ml de reactivo de Bradford a cada pocillo. Agitar la placa para mezclar el reactivo con las soluciones proteicas, teniendo cuidado de no derramar el contenido de cualquiera de los pozos. Espera 5 minutos.

13 Lea la placa de acuerdo con el protocolo específico para su lector de placas a una longitud de onda de 595 nm.

Calcular la concentración de anticuerpos

14 Copiar los valores leídos del lector de placas a Microsoft Excel.

15 Crear un gráfico a partir de las dos columnas de valores que representan el estándar de BSA usando el Asistente para gráficos en Microsoft Excel.

dieciséis Representar los puntos medidos a partir de las diluciones de anticuerpos en el gráfico de Excel. Leer la concentración correspondiente de proteína de acuerdo con el valor de la ordenada en el eje para el punto de dilución de anticuerpo en el gráfico de Excel.

17 Dependiendo de si usted está usando los valores obtenidos a partir de tubo A, B o C, se multiplica el valor por cualquiera de 20, 40 o 500, respectivamente. El valor resultante es la concentración de su anticuerpo purificado.

Consejos y advertencias

  • Utilizar tampones de suspensión libres de proteínas o sus resultados serán inexactos debido a que el reactivo de Bradford reacciona de forma no específica con la proteína.

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